Ontwikkeling van eiwithydrolyse om de voedingswaarde van vers bereid vlees en vis te verhogen.
Een wetenschappelijke onderbouwing door Dr. Adrian Hewson-Hughes | Nutrition, Food Safety & Innovation Advisor, GA Pet Food Partners..
Inleiding
Het dierlijke eiwitgehalte staat vast als de essentie van premium kwaliteitsvoeding voor honden en katten, en veel huisdiereigenaren erkennen dat het adagium "kwaliteit boven kwantiteit" hier van toepassing is. Volgens marktonderzoeksbureau Mintel zegt 59% van de kattenbezitters en 57% van de hondenbezitters dat de kwaliteit van het vlees belangrijker is dan het totale vleesgehalte in huisdiervoer (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners erkent dit al lang. Sinds de introductie van Freshtrusion® loopt GA voorop bij de ontwikkeling en productie van voeders die steeds meer vers bereid vlees en vis bevatten. De voordelen van het gebruik van verse vlees- en visbronnen ten opzichte van gedroogde, gesmolten vlees- en vismaaltijden, waaronder een betere smaak en een betere verteerbaarheid, worden door zowel huisdieren als hun eigenaren zeer gewaardeerd.
Streven om onze Partners nog betere producten aan te bieden.
De markt voor diervoeding is zeer dynamisch en hoewel het benadrukken van het exacte hoge aandeel vlees/vis/gevogelte in producten verstandig is, wordt dit een basisverwachting in plaats van de gewenste kwaliteit voor deze producten van huisdiereigenaren. Hier bij GA zijn we voortdurend op zoek naar manieren om Partners nog betere producten aan te bieden, en daarom zijn we op zoek gegaan naar het schijnbaar onmogelijke - een manier bedenken om onze verse vlees- en visingrediënten te koken zodat ze nog beter zijn voor huisdieren.
Het idee is om de voedingswaarde van het eiwit in onze verse vlees- en visingrediënten te verhogen door het eiwit om te zetten in kleine peptiden, die gemakkelijker worden opgenomen door de dieren die het eten (we noemen het 'HDP' - Highly Digestible Protein). Om ons bij deze zoektocht te helpen, hebben we deskundigen van Nofima, een toonaangevend onderzoeksinstituut voor toegepast voedselonderzoek in Noorwegen, gevraagd de omstandigheden voor enzymatische vertering van geselecteerde vlees- en visgrondstoffen te optimaliseren en deze te analyseren om aan te tonen dat we konden bereiken wat we wilden.
Eiwitvertering - ook wel proteolyse of hydrolyse genoemd
Eiwitten zijn grote moleculen die bestaan uit afzonderlijke "bouwstenen", aminozuren genaamd. Na het eten van voedsel dat eiwit bevat, begint het proces van proteolyse waarbij enzymen die vrijkomen in verschillende delen van het maag-darmkanaal het eiwit afbreken in aminozuren en kleine peptiden. Hierdoor kunnen deze bouwstenen worden opgenomen in het lichaam, waar ze opnieuw kunnen worden gecombineerd om nieuwe eiwitten te bouwen (zoals spieren, huid, haar, antilichamen, enzymen, hormonen, enz.)
Eiwitbronnen kunnen ook een gecontroleerd enzymatisch proteolyseproces ondergaan als onderdeel van hun voorbereiding voor opname in bereide levensmiddelen en voedingsproducten. Zo worden eiwithydrolysaten al tientallen jaren gebruikt in menselijke voeding, met name bij de productie van hypoallergene zuigelingenmelkformules voor baby's/kinderen die allergisch zijn voor koemelkeiwit.
Enzymatische of chemische hydrolyse
Eiwithydrolyse - het verbreken van peptidebindingen die aminozuren met elkaar verbinden door toevoeging van water - kan op verschillende manieren worden bereikt: chemisch met behulp van zuren of basen (alkalisch) of enzymatisch (de aanpak waarop wij ons richten). Hoewel de methoden van zure en alkalische hydrolyse van eiwitten het voordeel bieden van lage kosten, zijn er negatieve gevolgen voor de voedingskwaliteit van de geproduceerde hydrolysaten. Zure hydrolyse leidt tot volledige vernietiging van het essentiële aminozuur tryptofaan, en tot gedeeltelijk verlies van methionine, cystine en cysteïne (Pasupuleki & Braun, 2010). Evenzo resulteert alkalische hydrolyse in de volledige vernietiging van de meeste aminozuren, hoewel tryptofaan intact kan overleven (Dai, et al., 2014), (Hou, et al., 2017).
Vergeleken met zure en alkalische hydrolyse zijn de belangrijkste voordelen van enzymatische hydrolyse van eiwitten:
- De hydrolysevoorwaarden zoals temperatuur en pH zijn mild en leiden niet tot een bekend verlies van aminozuren.
- Het gebruik van protease-enzymen is specifieker en nauwkeuriger bij het regelen van de mate van hydrolyse en de grootte van de peptiden.
- De kleine hoeveelheden gebruikt enzym kunnen gemakkelijk worden gedeactiveerd (bijvoorbeeld door verhitting tot 80 - 85ºC gedurende ten minste 3 minuten) om de hydrolysereactie te stoppen. (Hou, et al., 2017).
Voedingsvoordelen van enzymatisch gehydrolyseerd eiwit: verteerbaarheid en absorptie van eiwit.
De voedingswaarde van eiwithydrolysaten hangt niet alleen af van de gebruikte methode van eiwithydrolyse, zoals eerder beschreven, maar ook van de samenstelling van de aanwezige vrije aminozuren, kleine peptiden (meestal di- en tri-peptiden) en grote peptiden. Historisch werd aangenomen dat alleen vrije aminozuren uit het maag-darmkanaal werden opgenomen door specifieke aminozuurtransporteurs. Dit komt inderdaad voor, maar nu wordt erkend dat de meeste aminozuren als di- en tri-peptiden worden opgenomen door de breed-specifieke peptidentransporter PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 kan potentieel alle 400 di-peptiden en 8.000 tri-peptiden vervoeren die het resultaat zijn van de combinatie van de 20 verschillende aminozuren uit de voeding (Daniel, 2004). Daarom wordt verwacht dat de inname van een eiwithydrolysaat met een hoog gehalte aan di- en tri-peptiden de vertering en absorptie van eiwitten zou vergemakkelijken, wat zou leiden tot een betere verteerbaarheid en een grotere biologische beschikbaarheid van aminozuren.
Het is duidelijk dat de beste omstandigheden voor enzym en hydrolyse essentieel zijn om eiwithydrolysaten met de gewenste uiteindelijke peptidegrootte te maken. De grootteverdeling van peptiden kan worden bepaald met een techniek die grootte-exclusiechromatografie wordt genoemd. Grootte-exclusiechromatografie (SEC) is een analytisch-chemische techniek waarbij mengsels van moleculen (zoals eiwitten of peptiden) die in een oplossing zijn opgelost, worden gescheiden door hun grootte (zie figuur 1).
FIGUUR 1. Eenvoudig overzicht van de scheiding van moleculen van verschillende grootte in een oplossing door middel van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De oplossing wordt aangebracht op een kolom die is gevuld met een hars van poreuze bolvormige bolletjes (grijze bolletjes). Grote moleculen (rode cirkels) kunnen niet in de poriën (gaatjes) van de bolletjes binnendringen en passeren daarom relatief snel de kolom en worden als eerste gedetecteerd. Kleinere moleculen in het monster kunnen de poriën in verschillende mate binnendringen, afhankelijk van hun grootte. Middelgrote" moleculen (groene cirkels) kunnen sommige korrels binnendringen maar andere niet en doen er dus langer over om door de kolom te gaan, terwijl de kleinste moleculen (blauwe cirkels) alle poriën kunnen binnendringen en er het langst over doen om door de kolom te gaan.
Methoden
Grondstoffen– Verse monsters van kippenkarkassen, eendenkarkassen en zalmframes werden verkleind, gehomogeniseerd tot een dikke pasta en ingevroren. Verse lamslever werd in zijn geheel ingevroren. Het materiaal werd verzonden naar Nofima, Ås, Noorwegen, voor proteolyse en analyse.
Proteolyse - Voor elke grondstof (kip, eend, zalm en lam) werd een monster van 500 g gemengd met 990 ml gedestilleerd water in een glazen reactievat en geroerd bij 300 rpm. Voor elke grondstof werden drie verschillende protease-enzymen getest bij twee verschillende concentraties en twee tijdstippen, wat resulteerde in 48 hydrolysaatmonsters voor analyse.
Grootte-uitsluitingschromatografie - De molecuulgewichtsverdeling van de in water oplosbare eiwitfractie van de hydrolysaten werd bepaald door middel van grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van een Shimadzu LC-20AT-systeem voor hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een fotodiode-arraydetector (SPD M20A) ingesteld op 214nm.
Collageenpeptidegehalte - Hydroxyproline is een gemodificeerd aminozuur waarvan de aanwezigheid voornamelijk beperkt is tot collageen. Het gehalte aan hydroxyproline in eiwithydrolysaten kan worden gebruikt als een indirecte maat voor de hoeveelheid aanwezig collageen/collageenpeptiden. Een volledige aminozuuranalyse (inclusief hydroxyproline) van elke grondstof werd uitgevoerd door Nofima Biolab; daarnaast werd het gehalte aan hydroxyproline bepaald in een erkend laboratorium (ALS, Noorwegen) in de in water oplosbare fractie van de hydrolysaten.
Resultaten
Peptidengrootteverdeling van hydrolysaten - In het algemeen resulteerde voor elk getest enzym de incubatie van elke grondstof met de hogere concentratie enzym en gedurende een langere periode in een "gunstige" verschuiving in het peptidengrootteprofiel van de hydrolysaten (d.w.z. een toename van het aandeel kleinere peptiden). Dit wordt duidelijk in figuur 2, waarin de resultaten voor elke grondstof met het "beste" enzym bij een "niet-optimale" concentratie en duur worden vergeleken met de "optimale" concentratie en duur. Bij geoptimaliseerde omstandigheden bleek 100% van de peptiden ≤3 kDa te zijn, en meer dan 75% < 0,5 kDa (figuur 2).
Op basis van het collectieve bewijs van verschillende studies bij een aantal soorten (bv. rat, varken, hond, mens; zie (Zhangi & Matthews, 2010) voor een overzicht, wordt algemeen aanvaard dat:
- Peptiden worden beter opgenomen dan intacte eiwitten
- De absorptie van peptiden is beter dan die van vrije aminozuren.
- De absorptie van kleine peptiden is beter dan die van grote peptiden
Fysiologisch worden de meeste aminozuren geabsorbeerd als kleine peptiden bestaande uit 2 of 3 samengevoegde aminozuren (respectievelijk di- en tri-peptiden). Daarom wordt verwacht dat de inname van een eiwithydrolysaat met een hoog gehalte aan di- en tri-peptiden de vertering en absorptie van eiwitten zou vergemakkelijken, wat zou leiden tot een betere verteerbaarheid en een grotere biologische beschikbaarheid van aminozuren. Het gemiddelde molecuulgewicht van een aminozuur is 110 Daltons (Da), zodat di- en tri-peptiden een molecuulgewicht zouden hebben van ongeveer 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Onze resultaten bij het bereiken van eiwithydrolysaten met meer dan 75% peptiden kleiner dan 0.5 kDa (d.w.z. tot ~ 5 aminozuren) betekenen dat het eiwit in onze brokken zeer goed verteerbaar zou zijn en gemakkelijk zou worden opgenomen door de huisdieren die het eten. Het is de bedoeling dit aan te tonen via een voedingsstudie in samenwerking met de Faculteit Diergeneeskunde van de Universiteit Gen.
Doordat 100% van de peptiden 3 kDa of kleiner zijn, wordt bovendien het risico op het opwekken van een allergische reactie op de eiwitbronnen verkleind, zodat deze als hypoallergeen kunnen worden beschouwd.
Figuur 2.
Grootteverdeling (kDa) van peptiden in de waterfase van hydrolysaten van elke grondstof geïncubeerd met hetzelfde enzym onder "niet-geoptimaliseerde" en "geoptimaliseerde" omstandigheden wat betreft enzymconcentratie en duur van de hydrolyse. Merk in het bijzonder op hoe het percentage peptiden tussen 1.0-3.0 kDa afneemt en peptiden <0.5 kDa toeneemt bij de overgang van "niet-geoptimaliseerde" naar "geoptimaliseerde" omstandigheden."
Collageenpeptide inhoud
Voor elke geteste grondstof presteerden de enzymen A en C in het algemeen "beter" (in termen van het terugwinnen van een groter percentage hydroxyproline in de waterfase van de hydrolysaten) dan enzym B bij vergelijking van een gegeven duur van de hydrolyse en enzymconcentratie (zie bijvoorbeeld de resultaten voor zalm in figuur 3).
Aangezien 'intact' collageeneiwit niet oplosbaar is in water, geeft de aanwezigheid van hydroxyproline (onze marker van 'collageen') in de waterfase aan dat het collageeneiwit is verteerd tot (in water oplosbare) collageenpeptiden. Onze resultaten illustreren dat wij met enzymatische proteolyse grondstoffen kunnen creëren die potentiële functionele voordelen bieden, zoals ondersteuning van de gezondheid van de gewrichten, de huid en de darmen door de aanwezige collageenpeptiden.
FIGUUR 3. Percentage hydroxyproline (een aminozuur dat bijna uitsluitend in collageen voorkomt) dat is teruggevonden in de waterfase van gehydrolyseerde zalm met drie verschillende enzymen (A, B of C) die in twee verschillende concentraties (C1 of C2) gedurende twee verschillende perioden (T1 of T2) met de grondstof (zalm) zijn geïncubeerd.
Conclusie
Deze positieve resultaten bieden mogelijkheden om extra waarde te halen uit de natuurlijke aanwezigheid van collageen in bepaalde grondstoffen door collageenpeptiden te creëren die functionele voordelen kunnen bieden, zoals het behoud van gezonde gewrichten bij actieve huisdieren en de verbetering van de mobiliteit en flexibiliteit van gewrichten bij oudere huisdieren.
Met het hoge percentage (>75%) kleine peptiden (<0,5kDa), geproduceerd onder 'geoptimaliseerde' omstandigheden op basis van dit onderzoek, is het eerste deel van ons HDP doel bereikt. De volgende belangrijke stap is aantonen dat brokken gemaakt met dit HDP inderdaad beter verteerbaar en biobeschikbaar zijn dan onze bestaande vers bereide producten - we zijn bezig dit uit te voeren in een voedingsstudie met de Universiteit van Gent Dierenarts school. Bekijk deze ruimte!
Referenties
- Cave, N., 2006. Gehydrolyseerde eiwitdiëten voor honden en katten. Veterinaire klinieken Praktijk voor kleine dieren, Volume 36, pp. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analyse van aminozuursamenstelling in eiwitten van dierlijke weefsels en voedingsmiddelen als pre-column o-ftaldialdehydederivaten door HPLC met fluorescentiedetectie.. J Chromatografie B, deel 964, blz. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Moleculaire en integratieve fysiologie van intestinaal peptidetransport. Jaaroverzicht van fysiologie, deel 66, blz. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Expressieklonering van een proton-gekoppelde oligopeptidetransporter van zoogdieren. Nature, Volume 7, blz. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Karakterisering van het molecuulgewicht van eiwitten en peptiden tijdens de productie van smaakpapillen voor huisdieren. [Online] Beschikbaar op: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Eiwithydroysaten in diervoeding: industriële productie, bioactieve peptiden en functionele betekenis. Journal of Animal Science and Biotechnology, blz. 24-36.
- Knights, R., 1985. Verwerking en evaluatie van eiwithydrolysaten. In: Voeding voor speciale behoeften. New York: Marcel Dekker, pp. 105-115.
- MINTEL, 2017. Meer transparantie op het gebied van eiwit in petfood, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. State-of-the-art productie van eiwithydrolysaten. In: Eiwithydrolysaten in de biotechnologie. New York: Springer, blz. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fysiologisch belang en mechanismen van absorptie van eiwithydrolysaat. In: Eiwithydrolysaten in de biotechnologie. New York: Springer, blz. 135-177.